Nat Neurosci︱突破！软膜层而非硬脑膜参与中枢神经系统自身免疫功能调控

撰文︱郭  宇

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

脑膜（meninges）不仅具有稳定和保护中枢神经系统的物理功能，而且还承担重要的免疫功能。 脑膜由三种不同的层组成。内层称为软脑膜（pia mater），与大脑和脊髓的神经组织紧密相连；第二层是无血管层，即蛛网膜层（arachnoid mater），脑脊液（CSF）在蛛网膜下腔循环；软脑膜和蛛网膜层共同组成软脑膜层（leptomeninges）；第三层是硬脑膜（dura mater），其在脑内直接与或经脊髓硬膜外腔与骨结构紧密相连，硬脑膜分布有淋巴管，能够将溶质和免疫细胞从CSF引流到淋巴结 [1]。

在健康的大脑和脊髓实质中，外周免疫系统几乎是无法触及的。因此，为了提供有效的保护作用，免疫细胞就需要守卫在这些组织结构的边界。这也是脑膜发挥作用的地方。脑膜上密集分布着常驻免疫活性细胞，即巨噬细胞。此外，T细胞可以在血液、软脑膜和CSF之间传播[2]。因此，脑膜被认为是健康中枢神经系统（CNS）免疫监测的重要部位[3,4]。当免疫系统失调时，即在CNS发生自身免疫性疾病过程中，如多发性硬化（MS），脑膜组织显著地参与炎症调控[5]。然而，在CNS自体免疫炎症过程中不同脑膜层的参与程度尚不清楚。

2022年6月30日，德国哥廷根大学医疗中心神经免疫学和多发性硬化症研究所的Francesca Odoardi和Alexander Flügel 团队在Nature Neuroscience杂志上发表了题为“Distinct roles of the meningeal layers in CNS autoimmunity”的研究论文，首次揭示了脑膜层在CNS自身免疫过程中的参与是不均衡的：效应T细胞的运输和激活局限于软脑膜，而硬脑膜在很大程度上被排除在外。

为了研究CNS自身免疫反应期间的脑膜炎症，研究人员将髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）注入到健康大鼠体内4-5天后，CNS组织病理学分析显示，疾病峰值阶段有强烈的脊髓软脊膜和脑实质炎症，并伴有大量效应T细胞和髓系细胞浸润（图1a,b）。相比之下，硬脑膜几乎没有任何炎症反应。此外，研究人员也在注入特异性效应T细胞共核蛋白（beta synuclein，bSYN）的大鼠脑内发现了类似的现象（图1c）。

图1 中枢神经系统发生自身免疫反应时免疫细胞浸润到脑膜

（图源：Merlini, et al., Nat Neurosci, 2022）

接下来，研究人员利用双光子激光扫描显微镜检测了效应T细胞在疾病条件下的迁移能力（即浸润能力），并分别观察其与硬脑膜和软脑膜血管直接的交互作用[6,7]。研究人员将荧光示踪剂3-kDa右旋糖酐经静脉注射后，示踪剂迅速从血管渗出并在硬脑膜血管周围的巨噬细胞处积聚，而非软脑膜区域。由此说明，硬脑膜的血管更通透。但是，效应T细胞与硬脑膜内皮细胞的相互作用相较于软脑膜内皮细胞少得多：大量的被荧光标记的T_MBP或T_bSYN细胞在软脑膜血管内运动，硬脑膜血管中却很少（图2a-c）。为了解释这些矛盾的发现，研究人员利用转录组研究，进一步分析了造成该现象的原因。结果显示，在硬脑膜血管中，介导紧密粘连的分子（例如纤维连接蛋白和CXCR3配体）表达水平显著降低，而在硬脑膜血管中介导T细胞和内皮细胞之间短暂相互作用的选择素（selectin）含量较高（图2d）[8]。上述结果表明效应T细胞更多的在软脑膜而非硬脑膜发挥免疫调节功能。换言之，软脑膜和硬脑膜具有出不同的功能和分子特征。

图2 软脑膜和硬脑膜血管功能存在显著差异

（图源：Merlini, et al., Nat Neurosci, 2022）

事实上，效应T细胞对硬脑膜血管的低结合能力并不能完全解释自身免疫过程中硬脑膜和软脑膜参与的差异，因为，效应T细胞仍然能成功地迁移到硬脑膜环境中。因此，研究人员提出疑问：由于缺乏刺激性输入而导致免疫细胞对硬脑膜的渗透减少？由于脑内效应T细胞在CNS内与吞噬细胞接触后被重新激活，吞噬细胞将抗原呈递给T细胞[9]。重新激活的效应T细胞释放促炎细胞因子。同时，小胶质细胞和星形胶质细胞受到刺激产生细胞因子和趋化因子，诱导免疫细胞的招募[6]。研究人员发现，硬脑膜中细胞因子和趋化因子水平降低，且硬脑膜效应T细胞相比软脑膜和脑实质效应T细胞，其表达的促炎细胞因子水平更低（图3）。

图3 T细胞在软脑膜而非硬脑膜发生显著激活

（图源：Merlini, et al., Nat Neurosci, 2022）

硬脑膜内有淋巴管，局部淋巴管通过硬脑膜将抗原引流至颈深部淋巴结（deep cervical lymph nodes，dcLNs）[10]。当受到相应抗原刺激时，抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）与T细胞产生交互，从而诱导T细胞活化。为了探究硬脑膜、软脑膜、dcLNs中APCs对CNS抗原呈递的优先顺序。研究人员在动物体内注射了DQ-OVA（一种自身淬灭的卵白蛋白偶联物，在蛋白水解时具有荧光），通过细胞荧光测定法对软脑膜、硬脑膜和dcLNs中荧光标记的APCs进行定量。结果发现，与硬脑膜和dcLNs相比，软脑膜内的荧光细胞数量明显更高（图4）。除此之外，研究人员还将T_OVA细胞注入脑脊液中，发现大部分T_OVA细胞位于软脑膜，少数位于硬脑膜和dcLNs。上述结果提示软脑膜是效应T细胞发生抗原提呈的关键部位。

图4 软脑膜是T细胞抗原提呈关键部位

（图源：Merlini, et al., Nat Neurosci, 2022）

在多发性硬化症（MS）疾病中经常观察到脑膜浸润[11]。因此，研究人员探究了不同的脑膜层在慢性自身免疫疾病模型中扮演什么角色。研究发现，在MS大鼠模型中，软脑膜明显增厚，T细胞和CD11b⁺髓系细胞形成有规律的聚集。有意思的是，在这种慢性炎症情况下，硬脑膜几乎没有炎症激活。究其原因，不论是急性还是慢性自身免疫性CNS病变，硬脑膜或dcLNs内都不会发生自发地呈递自身抗原，而软脑膜可以。研究人员通过对MS患者样本检测发现，病人软脑膜中有大量的T细胞浸润，而硬脑膜内则没有。通过对软脑膜和硬脑膜区域的CD8⁺ T细胞的定量发现，T细胞在软脑膜浸润明显超过硬脑膜各区域（图5）。这些结果提示软脑膜T细胞免疫功能异常在MS的病理进程发挥关键作用。

图5 软脑膜而非硬脑膜参与MS病理进程调控

（图源：Merlini, et al., Nat Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究在自身免疫性动物模型和多发硬化（MS）患者脑组织中，揭示了软脑膜层而非硬脑膜层在自身免疫性疾病进程中发挥关键作用。在软脑膜中，抗原提呈细胞提呈抗原能力增强，加剧了效应T细胞的激活，促进了局部炎症反应和炎症因子的激活。该项研究首次系统地揭示了软脑膜是效应T细胞主要的运输和激活场所，对比之下，硬脑膜很大程度上被排除在中枢神经系统自身免疫过程之外。

硬脑膜被广泛认为是CNS免疫监测的重要平台，也是CNS自身免疫病理过程的起源。因而，硬脑膜是否在其它脑部疾病病理进程发挥更突出的作用，有待于进一步研究。除此之外，在临床前模型研究中，对软脑膜还是硬脑膜进行免疫功能调节治疗MS有待于进一步考证。总之，本研究创新性揭示了不同脑膜层结构参与免疫功能调节，为理解自身免疫性脑炎的病理生理机制提供了重要的科学价值。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41593-022-01108-3

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Louveau, A. et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature 523, 337–341 (2015).

[2] Schläger, C. et al. Efector T-cell trafcking between the leptomeninges and the cerebrospinal fuid. Nature 530, 349–353 (2016).

[3] Korn, T. & Kallies, A. T cell responses in the central nervous system. Nat. Rev. Immunol. 17, 179–194 (2017).

[4] Rua, R. & McGavern, D. B. Advances in meningeal immunity. Trends Mol. Med. 24, 542–559 (2018).

[5] Lucchinetti, C. F. et al. Infammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. N. Engl. J. Med. 365, 2188–2197 (2011).

[6] Lodygin, D. et al. β-Synuclein-reactive T cells induce autoimmune CNS grey matter degeneration. Nature 566, 503–508 (2019).

[7] Flügel, A., Willem, M., Berkowicz, T. & Wekerle, H. Gene transfer into CD4⁺T lymphocytes: green fuorescent protein-engineered, encephalitogenic T cells illuminate brain autoimmune responses. Nat. Med. 5, 843–847 (1999).

[8] Zarbock, A., Ley, K., McEver, R. P. & Hidalgo, A. Leukocyte ligands for endothelial selectins: specialized glycoconjugates that mediate rolling and signaling under fow. Blood 118, 6743–6751 (2011).

[9] Lodygin, D. et al. A combination of fuorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nat. Med. 19, 784–790 (2013).

[10] Louveau, A. et al. CNS lymphatic drainage and neuroinfammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nat. Neurosci. 21, 1380–1391 (2018).

[11] Howell, O. W. et al. Meningeal infammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain 134, 2755–2771 (2011).

本文完